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細胞體外培養用水中水的質(zhì)量要求
提起細胞體外培養實(shí)驗，每個(gè)經(jīng)歷過(guò)的實(shí)驗者都會(huì )有這樣的領(lǐng)悟吧，
細胞虐我千百遍，我待細胞如初戀。
明明小心翼翼的操作，
細胞總會(huì )莫名其妙的被污染了！
莫名其妙的掛掉啦！
到底怎么回事呢？
其實(shí)造成細胞污染的因素不單單是微生物，培養環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會(huì )影響細胞的生長(cháng)。水是細胞賴(lài)以生存的主要環(huán)境，營(yíng)養物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中，才能為細胞吸收和排泄。對于體外培養的細胞來(lái)說(shuō)，水是所有細胞培養液和試劑中簡(jiǎn)單、但也是重要的組分。所以，細胞培養對水的質(zhì)量要求較高，培養用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì )影響細胞的存活和生長(cháng)，甚至導致細胞死亡。
水中的雜質(zhì)對水質(zhì)有不同影響：
1.離子——平衡滲透壓；一些重金屬 (Cadmium)對細胞毒害大，即便劑量很低 (< 0.1 ppb)；
2.微生物——污染，改變微環(huán)境如pH，影響增殖，死后釋放內毒素等；
3.內毒素——改變細胞外形、活化細胞、促進(jìn)或抑制細胞分裂、影響細胞附著(zhù)等；
4.有機物——影響細胞的生長(cháng)狀態(tài)。
水質(zhì)評價(jià)常用的指標：
1. 電阻率（electrical resistivity）
衡量實(shí)驗室用水導電性能的指標，單位為MΩ•cm，隨著(zhù)水內無(wú)機離子的減少電阻數值逐漸變大。
2. 異體菌落數（Heterotrophic bacteria count，HBC）
衡量實(shí)驗室用水微生物的指標，單位為cfu/mL。
3. 有機物（Total Organic Carbon ，TOC）
水中碳的濃度，反映水中可氧化的有機化合物的含量，可間接反映出水中細菌和內毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。
4. 內毒素（Endotoxin）
革蘭氏陰性細菌的脂多糖細胞壁碎片，又稱(chēng)之為“熱原”，單位EU/mL。
參考標準化組織的實(shí)驗室純水規范ISO3696，美國CLSI和ASTM D1193的試劑純水規范，我國GBT6682和GBT 30301的試驗用水指導，《實(shí)驗細胞資源的描述標準與管理規范》用水指導，結合多年的實(shí)驗操作經(jīng)驗，總結出細胞培養用水對水質(zhì)的要求。
細胞培養對水質(zhì)的要求：
1.一定要無(wú)菌：HBC < 0.01 cfu/mL
2.無(wú)蛋白及核酸酶和內毒素：無(wú)內毒素或無(wú)熱源<0.03EU/mL
3.阻礙細胞生長(cháng)的有機物含量要低：TOC <5 ppb
4.去除離子含量：電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)
細胞體外培養用水中純水機的配置要求
細胞培養過(guò)程中，各種培養液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過(guò)嚴格的純化處理，不含離子和其他的雜質(zhì)，即使是儲存試劑的玻璃器皿，在自來(lái)水沖洗過(guò)后也應用超純水漂洗三次以上。目前，市場(chǎng)上供應的純水裝置種類(lèi)較多，比如自來(lái)水進(jìn)水同時(shí)制備二級純水和超純水的上海樂(lè )楓Genie一體化純水裝置，可以由自來(lái)水進(jìn)水通過(guò)預處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI（連續電流電去離子）模塊等純化后達到二級純水，儲存于水箱中以滿(mǎn)足日常的清洗應用；水箱中的水再經(jīng)過(guò)U Pack超純化柱去離子，紫外燈照射殺菌并降低有機物含量，后經(jīng)終端濾器RephiBio過(guò)濾，以獲得無(wú)菌、無(wú)熱源、無(wú)核酸酶的超純水。
水路圖
要想達到細胞培養用水的水質(zhì)要求，純水機的配置非常關(guān)鍵，帶有消毒模塊的純水水箱、終端過(guò)濾器、取水水質(zhì)的實(shí)時(shí)監測等配置都關(guān)系著(zhù)產(chǎn)水水質(zhì)是否達標。
純水的儲存對保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的，由于周?chē)h(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH，所以?xún)Υ嫠娜萜饕M量密封，避免和外界過(guò)多接觸，抑制微生物生長(cháng)。如Genie純水設備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過(guò)濾器，能夠大限度的保證水箱內的純水水質(zhì)。
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| 水箱空氣過(guò)濾器（含CO2吸附劑） | 200/350L 水箱空氣過(guò)濾器 |
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| 主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài) | |
終端濾器可用于去除純水中特定類(lèi)型的污染物，滿(mǎn)足不同實(shí)驗的應用需求。對于細胞體外培養可以選用RephiBio Filter 純水終端過(guò)濾器，安裝在樂(lè )楓超純水系統的出水口，可有效去除水中的熱原（內毒素）、核酸酶、細菌等雜質(zhì)，制備符合細胞培養用水要求的超純水（無(wú)熱原、無(wú)DNase、無(wú)RNase、無(wú)菌）。
對于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率、細菌和內毒素的含量，必須做到即取即用，因此取水的遠程監控和水質(zhì)實(shí)時(shí)監測就顯得尤為重要。目前已有廠(chǎng)家可以提供與手柄通過(guò)無(wú)線(xiàn)連接的實(shí)驗室純水機（如上面提到的Genie），將水機和取水手柄分別放在潔凈間的內外，通過(guò)無(wú)線(xiàn)控制取水手柄達到超純水的取用和實(shí)時(shí)檢測水的電阻率和TOC數值，非常適合無(wú)菌環(huán)境下的操作，大限度減少污染。
| 無(wú)線(xiàn) · 自由 |  |
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| 手柄觸屏信息
? 系統運行狀態(tài)：待機，泄壓，循環(huán)，產(chǎn)水 ? 水箱液位：0%或者L ? 純水（超純水）水質(zhì)參數：電阻率、TOC、溫度 |
終 端 水 質(zhì) 實(shí) 時(shí) 監 測 |
結合上述用水要求，為大家推薦兩款制備超純水的水機，Genie G一體化純水儀和Genie PURIST 超純水儀。
Genie G一體化純水儀 以自來(lái)水為進(jìn)水制備超純水和 EDI 二級純水 | 性能指標
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Genie PURIST 超純水儀 以純水（EDI 純水，RO 水或蒸餾水等）為進(jìn)水，制備實(shí)驗室超純水。 | 性能指標
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【注意事項】
1.超純水應當注意使用時(shí)間，應該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導致水質(zhì)下降。
2.在合適的環(huán)境使用超純水。環(huán)境中的VOC（揮發(fā)性有機物），細菌等都會(huì )影響細胞培養。
3.培養細胞的容器應當潔凈無(wú)污染。
4.配制離散細胞用的消化液和細胞洗滌液時(shí)，宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液，緩沖液用水可以選用裝配樂(lè )楓低鎂型純化柱的純水機，避免鈣、鎂離子促使細胞凝聚作用的產(chǎn)生。
不同細胞體外培養用水選擇指南
細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養條件等），使之生存、生長(cháng)、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養的整個(gè)流程中實(shí)驗用水貫穿每一個(gè)環(huán)節：
1.取材：組織的清洗和灌注試劑用水，如PBS緩沖液、Hanks液的配制；
2.原代培養：1640、DMEM等培養基用水，明膠等支持物的配制，添加藥物、檢測試劑的配制；
3.傳代培養：胰酶等消化液的配制；
4.凍存：細胞凍存液DMSO的配制。
細胞體外培養的細胞類(lèi)型一般分為動(dòng)物細胞培養、植物細胞培養和微生物培養，其中難的是動(dòng)物細胞的培養。動(dòng)物細胞的培養除了需要無(wú)菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件，它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì)，其中原代細胞的培養是難的。植物細胞的培養需要光照和激素，而且培養條件和培養技術(shù)比較成熟。微生物培養多為單細胞生物，微生物人工培養的條件比動(dòng)植物細胞簡(jiǎn)單得多，蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養基即可滿(mǎn)足微生物的營(yíng)養要求，其中厭氧微生物培養比好氧微生物復雜，需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。
由于細胞的種類(lèi)和培養條件不同，對培養環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同，那么配制培養基或試劑用水的選擇大有講究，不同細胞體外培養用水的指標如下：
細胞體外培養用水選擇
細胞類(lèi)型 | 純水等級 | 電阻率 (MΩ·cm) | TOC (ppb) | 微生物 (cfu/mL) | 內毒素(Eu/mL） | 核酸酶 (pg/mL) |
動(dòng)物細胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
植物細胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
微生物 | 實(shí)驗室Ⅱ級純水 | >10 | <50 | <1 | NA | NA |
從上表可以看出，動(dòng)物細胞和植物細胞的培養對去除內毒素和核酸酶的要求很高，用于這兩類(lèi)細胞培養可以選擇商品化的細胞培養用水，另外去除純水中的內毒素和核酸酶可以通過(guò)在純水機的取水口安裝終端濾器達到。
各種細胞培養用水的比較
細胞培養用水 | 制備方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
商品化細胞培養用水 | 純水或超純水進(jìn)行多效蒸餾制成，嚴格控制熱源、無(wú)菌、內毒素、pH、滲透壓等指標 | 水質(zhì)標準程度化高，可保證實(shí)驗結果的重復性 | 價(jià)格昂貴 |
DEPC水 | DEPC處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，無(wú)RNase、DNAase和proteinase。 | *去除核酸酶 | 價(jià)格昂貴，未去除內毒素 |
終端濾器過(guò)濾超純水 | 采用0.22µm的過(guò)濾膜，可有效去除水中的熱原（內毒素）、核酸酶、細菌等雜質(zhì)。 | 性?xún)r(jià)比高，供水量大 | 對取水環(huán)境要求高 |
樂(lè )楓 RephiBio 終端過(guò)濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過(guò)濾膜，可制備符合生物領(lǐng)域應用要求的超純水（無(wú)熱原、無(wú)DNase、無(wú)RNase、無(wú)菌），純水中內毒素含量低于0.001 Eu/mL，核酸酶的含量低于可檢測范圍，微生物的含量低于0.1 cfu/mL，可以滿(mǎn)足動(dòng)物細胞和植物細胞的需求。
Tips: 通常情況下樂(lè )楓RephiBio 終端過(guò)濾器的更換周期為3 個(gè)月，以保證使用效果。
